注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
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芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;大波斯菊苷Integrin Alpha4 Beta7/LPAM-1 (Lymphocyte Peyer’s patch Adhesion Molecule 1/Integrin alpha4,beta7)  整合素α4β7抗原Transferrin  轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體

遼東楤木皂苷VIntegrin AlphaE2/CD103  整合素αE2抗原Transcription factor 25/Nulp1  核轉(zhuǎn)錄因子25抗體

遼東楤木皂苷XENPP3/CD203c(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3)  ENPP3抗原Transaldolase 1  轉(zhuǎn)酶抗體

遼東楤木皂苷VIIIQGAP1  支架蛋白抗原TRAK1  驅(qū)動蛋白結(jié)合蛋白1抗體

阿魏酸乙酯IRF-1(Interferon regulatory factor-1)  干擾素調(diào)節(jié)因子抗原TRAILR2/DR5/CD262  腫瘤細(xì)胞調(diào)亡素/死亡受體5抗體

IRAK 2  白介素-1受體相關(guān)激酶2TRAILR1/DR4/APO2  死亡受體4抗體

茶堿IL-1RA (Interleukin-1 receptor antagonist)peptide  白介素-1受體拮抗劑抗原TRAIL  腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體抗體

D十-無葡萄糖Integrin a7(integrin alpha 7)  整合素α7抗原TRAF7  腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子7抗體

脫穿心蓮內(nèi)酯integrin Beta1(ITG- Beta1/CD29)  粘附分子整合素β1抗原TRAF6  腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6抗體
犬血支原體PCR檢測試劑盒廠家人T細(xì)胞特異性鳥苷三磷酸酶(Tgtp)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人XC趨化因子受體1(XCR1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃25克

人α/β干擾素受體(IFN-α/βR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT500支/包

人α1β糖蛋白(α1β-GP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：5克

人α1抗胰蛋白酶(α1-AT)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃5克

人α1抗胰糜蛋白酶(AACT)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人α1酸性糖蛋白(α1-AGP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT支

人α1微球蛋白(α1-MG)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1克*5
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。