注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
索拉非尼C22H28N2O4辛酸酯

二酸組；酸組C17H24O52-氨基-5-溴-羥基嘧啶

酸喹,喹二酸鹽C19H26O72,6-二甲

(-)-莨菪,L-天仙子，L-天仙子C20H24O72H-2-酸 -1,2,三氮唑

(-)-莨菪,L-天仙子，澳洲毒茄(標(biāo)準(zhǔn)品)C20H18O10對甲氧基

葡聚糖D70/右旋糖苷C7H7NO2并噻唑-2-

右旋糖苷/葡聚糖D40C44H64O242-基-

葡聚糖D20/右旋糖苷C22H33NO25-溴-1-甲基-1,2,噻唑

沙格列汀/沙克列汀鹽酸鹽C24H39NO62-氟-5-吡啶酸

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG95%）C46H58N4O92--甲基-5-溴吡啶

達(dá)沙替尼一水合物C7H6O4L-甲氧基扁桃酸

依西美坦C8H8O21,2-二

依西美坦(標(biāo)準(zhǔn)品)C7H6O31-氨基-2-甲基-2-

氨基比林C5H4O3基香蘭素縮

馬來酸那敏/撲爾敏C40H56O2間異酸酯

馬來酸那敏/撲爾敏(標(biāo)準(zhǔn)品)C36H36N2O8N-甲基-甲氧基芐

血管緊張素IIC21H20O10-三氟

維生素 D3 ((膽骨化)C34H30O15-2-溴甲

分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA試劑盒CD9/MRP-1  CD9蛋白100 ul

分泌型脂酶A2(sPLA2)ELISA試劑盒CD40L  CD40L100 ul

肺炎支原體(MP)(IgG)ELISA試劑盒Ingrin alpha 2b/CD41  血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa100 ul

肺部活化調(diào)節(jié)趨化因子(PARC/CCL18)ELISA試劑盒CD43/SPN  CD431 Kit

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(SP-C)ELISA試劑盒CD44/PGP1  CD44100 ul

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B(SP-B)ELISA試劑盒CD44v4  CD44V4100 ul

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SP-A)ELISA試劑盒CD44v5  CD44V5100 ul

肺表面活性蛋白D(SP-D)ELISA試劑盒CD44v6  CD44V6100 ul

肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(MCT)ELISA試劑盒CD44v7  CD44V71 Kit
軍團(tuán)桿菌PCR檢測試劑盒規(guī)格腫瘤/抗原家族4亞型7抗體Cynaside F中文名：別名：分子式：C41H62O15

神經(jīng)細(xì)胞膜糖蛋白M6bPeriplocoside F中文名：別名：Periploside F分子式：C63H104O23

FK506結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白抗體（他克莫司相關(guān)蛋白）7α-Methoxy-5α,6α-epoxyergosta-8(14),22-dien-3β-ol中文名：別名：5α,6α-Epoxy-7α-methoxyergosta-8(14),22-dien-3β-ol分子式：C29H46O3

G蛋白偶聯(lián)受體激酶5抗體Minisecolide C中文名：別名：分子式：C28H34O7

磷酸化糖原合酶激酶-3α抗體Withaphysalin A中文名：別名：分子式：C28H34O6
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。