注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
纖維素酶(酶活>45 U/mg)Phospho-EphA2 (Tyr588) (D7X2L) Rabbit mAb芐基嗎啉-2-甲

化十六烷基吡啶一水(分子生物學(xué)級(jí))SignalSilence® γ-Canin siRNA II (Mouse Specific)(R)-哌-2-羧酸

醋酸鉛三水(>99%，BC)MDR1/ABCB1 (D3H1Q) Rabbit mAb2-溴-氨基-6-甲基吡啶

派洛寧Y(Ind Grade)AFAP1L2/XB130 (D1B5) Rabbit mAb雙酚酸

對(duì)羥基甲酸鈉(>99%,BR)Phospho-MCM3 (Ser112) (D3S4M) Rabbit mAb2-(2-吡啶酮-1-基)-1,1,3,四甲基脲四氟酸鹽

魚(yú)精蛋白硫酸鹽來(lái)源于鮭魚(yú) VEGF Receptor 2 (D5B1) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)羥基-三氟

5-溴--吲哚基酸鹽鈉鹽(分子生物學(xué)級(jí))His-Tag (D3I1O) XP® Rabbit mAb (HRP Conjuga)甲基-酮基-N-基戊酰

酸銅水合物(>99%，BR)xCT/SLC7A11 (D2M7A) Rabbit mAb甲基-5-

酸肌酸鈉鹽四水SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Dection Kit3,5-二氟-基酚

3,3'-二氨基聯(lián)四鹽酸二水(>99%，BR)Phospho-Akt (Ser473) (D9W9U) Mouse mAb3,5-二氟酮

1,6-二酸果糖三鈉鹽(98-101.0%，BR)Phospho-Tyrosine (P-Tyr-1000) MultiMab™ Rabbit mAb mix (HRP Conjuga)2-甲基戊

1,6-二酸果糖三鈉鹽(98-101.0%，BR)β-Arrestin 1 (D8O3J) Rabbit mAb對(duì)基酚

銨(>99%，BR)His-Tag (D3I1O) XP® Rabbit mAb2-(甲基氨基)基氨酸叔丁酯

四甲基對(duì)(>99%，BR)His-Tag (D3I1O) XP® Rabbit mAb1-Boc-吡咯烷甲酸甲酯

1,3,5-三羥基二水合物(>98%，BR)XPC Antibody4,二氟環(huán)己甲酸

碳酸無(wú)水(>98%，BR)XPC AntibodyFmoc-L-谷氨酸-α-芐酯

?；撬?/font>(>98.5%，JP )Prosta Specific Membrane Antigen (D4S1F) Rabbit mAb氨基-6--1,二磺酰

草酸銨(98~101%,BR)IL-1β (D3U3E) Rabbit mAb正戊(烷)基酸

山羊白介素6(IL-6)ELISA試劑盒phospho-ERK1/MAPK-1/2(Thr183/185)  酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2100 ul

山羊白介素4(IL-4)ELISA試劑盒phospho-ERK1(Thr202/Tyr204)  酸化絲裂原活化蛋白激酶1100 ul

山羊白介素2受體(IL-2R)ELISA試劑盒ERK1/2(p44/42 MAPK)  絲裂原活化蛋白激酶1/2100 ul

山羊白介素2(IL-2)ELISA試劑盒phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204)  酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2100 ul

山羊白介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒phospho-ERK1(Thr202/Thr204)+ERK2(Thr183/Tyr185)  酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2100 ul

山羊白介素1α(IL-1α)ELISA試劑盒phospho-ERK1(Thr197/Thr202)  酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2100 ul

山羊白介素18(IL-18)ELISA試劑盒Eph receptor B2/Ephb2   Ephb21 Kit

山羊白介素12(IL-12/P40)ELISA試劑盒ERK1/MAPK3  絲裂原活化蛋白激酶3100 ul

山羊白介素10(IL-10)ELISA試劑盒MAPK4  絲裂原活化蛋白激酶4100 ul
木瓜PCR檢測(cè)試劑盒廠家電壓依賴性鈣通道CACNA1G+CACNA1H抗體Isoferulic acidCAS .：25522-33-2別名：trans-3-Hydroxy-4-methoxycinnamic acid分子式：C10H10O4性狀：Powder

鈣結(jié)合蛋白1抗體threo-1-C-Syringylglycerol中文名：別名：分子式：C11H16O6

神經(jīng)型一氧化氮合成酶結(jié)合蛋白抗體Coniferaldehyde中文名：松柏醛別名：4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde分子式：C10H10O3

毒蕈堿型乙酰膽堿受體M4抗體Sinapaldehyde glucoside中文名：芥子醛葡萄糖苷別名：Sinapaldehyde 4-O-β-D-glucopyraside分子式：C17H22O9

甘氨酸結(jié)合蛋白抗體Hexacosyl (E)-ferulate中文名：別名：分子式：C36H62O4
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。