注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
化鉛(>99%,BR)Myosin Light Chain 2v (D5I1C) (Cardiac Isoform) Rabbit mAb (Rodent Specific)-2-酚

檸檬酸鋰四水(>98%,BR)SMN1 (2F1) Mouse mAb2-萘甲酸

甲基傘形酮酰-beta-D-吡喃糖苷TMEM49/VMP1 (D6N4G) Rabbit mAbN-(5-氨基-2-基)-(吡啶基)-2-氨基嘧啶

甲基傘形酮酰-Β-D-吡喃葡糖酸苷Filamin B (D7E4W) Rabbit mAb6--甲基尿嘧啶

甲基傘花基酸鈉三水Catalase (D4P7B) XP® Rabbit mAb2-甲基-羥基甲

萘(>98%，BC)Catalase (D4P7B) XP® Rabbit mAb四二二對(duì)甲磺酸酯

對(duì)氨基酚(>98%,BR)Mannose Receptor Antibody2,6-二羥

1,雙(5-基-2-噁唑基)(>98%,Scint Grade)PSMD10/Gankyrin Antibody5-丁基噁唑-2,二酮

溴酸(>98%,BC)Epothilone B2-巰基噻唑啉

氟化(>98%,BR)MSH6 (3E1) Mouse mAb-溴

2,5-二基惡唑(>98%,BC)β-Amyloid (1-40 Specific) (D8Q7I) Rabbit mAb2-氨基-三氟甲酸

酸鈉(>98%,BR)UBE2T (D2L7H) Rabbit mAb芐氧酸

司班60Spry1 (D9V6I) Rabbit mAb(S)-S-哌啶-甲酸鹽酸鹽

二氧化鈦(>99%,BR)Atg5 (D5F5U) Rabbit mAbNε-(叔丁氧羰基)-Nα-芐氧羰基-L-賴氨酸

三基(>98%,BR)Atg5 (D5F5U) Rabbit mAb2-氨基-5-(三氟甲氧基)甲酸

曲拉通X-405(69.0~71.0%)Vatalanib2,二-5-硝基-6-甲基嘧啶

尿胰蛋白酶抑制劑RKIP (D42F3) Rabbit mAb5--并噻吩

氧化鋅(>98%,BC)Phospho-YAP (Ser127) (D9W2I) Rabbit mAb溴-1-并呋喃

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3(TIMP-3)ELISA試劑盒Phospho-FGF Receptor 1 (Tyr766)  酸化性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)ELISA試劑盒FGFR2/CD332  成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體21 Kit

基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/Gelatinase B)ELISA試劑盒FGFR3/CD333  成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)ELISA試劑盒FGFR4/CD334  成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)ELISA試劑盒FGL2  凝血酶原酶100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶5(MMP-5)ELISA試劑盒Fibulin 1  “衰老關(guān)鍵蛋白”100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶4(MMP-4)ELISA試劑盒Fibulin 5  “衰老關(guān)鍵蛋白”100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶3/基質(zhì)裂解素1(MMP3/STR1)ELISA試劑盒human Fibrinogen  可溶性纖維蛋白原100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶25(MMP25)ELISA試劑盒human Fibrinogen  纖維蛋白原100 ul
牛白血病病毒PCR檢測(cè)試劑盒規(guī)格蛋白激酶B3Peiminine中文名：貝母素乙別名：Verticine; 浙貝乙素分子式：C27H433

肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Girdin抗體Imperialine中文名： 西貝素別名：Sipeimine分子式：C27H433

粘附相關(guān)激酶抗體Peimine中文名：貝母素甲別名：Verticine; 浙貝甲素分子式：C27H453

磷酸化粘附相關(guān)激酶抗體N-Methylflindersine中文名：別名：分子式：C15H152

磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子4抗體Evodiamine中文名：吳茱萸堿別名：(+)-Evodiamine分子式：C19H17N3O
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。