注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
1,6-己二(>98%,BR)Phospho-YAP (Ser127) (D9W2I) Rabbit mAb7-二氨基-甲基

2,二氧基酸鈉(>98%,BR)FAK (D2R2E) Rabbit mAb2--甲氧基

4(5)-甲基咪唑(>98%,BR)PathScan® Total HER4/ErbB4 Sandwich ELISA Kit2-溴-1-氟-

氧基酸鈉(>98%,植物激素級(jí))Spry1 (D9V6P) Rabbit mAb2-氟磺酰

氫氧化鋁(>98%,BR)IRF-7 (D2A1J) Rabbit mAbN-甲基-L-脯氨

酸銨三水(>98%,BR)PathScan® Phospho-Rb (Ser780) Sandwich ELISA Kit溴-2-三氟酚

碳酸鋇(>99%,BR)TORC2/CRTC2 (5B10) Mouse mAb2--氟芐

甲酰(>98%,BR)S100A4 (D9F9D) Rabbit mAb2,二氨基酚

比布里希猩紅(>90%,BS)Phospho-S6 Ribosomal Proin (Ser240/244) (D68F8) XP® Rabbit mAb (Biotinylad)溴-N-基咔唑

檸檬酸鈣；檸檬酸鈣四水SARM1 (D2M5I) Rabbit mAb羥基金剛烷

硫酸銫(分子生物學(xué)級(jí))Phospho-CDCP1 (Tyr806) Antibody2-羥基-6-甲

銅片PFKFB2 (D5I5F) Rabbit mAb2-甲氧基-5-硝基三氟甲

化亞銅(>97%,BR)LKB1 (D60C5F10) Rabbit mAb (IHC Formulad)3,5,3',5'-四甲基-4,4'-二羥基聯(lián)

化亞銅(>99%,BR)LKB1 (D60C5F10) Rabbit mAb (IHC Formulad)N,N-二酸鹽酸鹽

2'-脫氧鳥苷5'二酸二鈉鹽PathScan® Total M-CSF Receptor Sandwich ELISA Kit氮雜環(huán)丁烷-甲酸甲酯鹽酸鹽

D-葡萄糖酸鈉(> 98%，BR)MEK1/2 (D1A5) Rabbit mAb (HRP Conjuga)氨基-2-甲氧基嘧啶

二四酸二鈉一鈣鹽AKR1C2 Antibody2,二-3,5-二酚

聚蔗糖70PDK1 (D4Q4D) Rabbit mAb2,二煙酸

基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A(MMP-2/Gelatinase A)ELISA試劑盒human Fibrinogen  纖維蛋白原100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶1酶原(Pro-MMP-1)ELISA試劑盒FLASH/CASP8AP2  半胱氨酸蛋白酶8相關(guān)蛋白2100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶14(MMP-14)ELISA試劑盒FLG(filaggrin)  絲聚蛋白/中間絲蛋白100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)ELISA試劑盒FLIP S/L   凋亡調(diào)節(jié)基因之一100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶12(MMP-12)ELISA試劑盒FLIPS  凋亡調(diào)節(jié)基因之一（短型）100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒FLT-3/CD135  FMS樣酪氨酸激酶3100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)ELISA試劑盒Phospho-FLT3 (Tyr591)  酸化FMS樣酪氨酸激酶3100 ul

基質(zhì)γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)ELISA試劑盒Phospho-FLT3 (Tyr589/591)  酸化FMS樣酪氨酸激酶320 ul

基膜聚糖/內(nèi)腔蛋白(LUM)ELISA試劑盒Phospho-FLT3 (Tyr842)  酸化FMS樣酪氨酸激酶3100 ul
牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測(cè)試劑盒廠家軸蛋白1抗體Quercetin dimer中文名：別名：分子式：C30H18O14

膜粘連蛋白A1抗體Narcissin中文名：仙苷別名：Isorhamnetin 3-O-rutiside; 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷分子式：C28H32O16

β淀粉樣肽1-16/Aβ1-16 抗體3'',4''-Di-O-p-coumaroylquercitrin中文名：3'',4''-二-O-對(duì)香豆酰槲皮苷別名：Quercetin 3-O-(3”,4”-di-E-p-coumaroyl)-α-L-rhampyraside分子式：C39H32O15

自噬相關(guān)蛋白1抗體Procyanidin B-5 3,3'-di-O-gallate中文名：原花青素B5-3,3'-二-O-沒食子酸酯別名：Procyanidin B5 3,3'-di-O-gallate分子式：C44H34O20

腺瘤肉調(diào)節(jié)蛋白抗體2,3-Dihydroamentoflavone中文名：2,3-二氫穗花杉雙黃酮?jiǎng)e名：分子式：C30H20O10
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。